压电物镜定位台之显微镜图像处理

2020-03-05 15:00:26 NanoMotions 972

前言

数字共焦显微技术是一种新型的共焦显微技术，该技术以普通光学显微镜为基础，采集一系列生物细胞的序列切片图像，并在计算机上采用数学算法对切片图像进行去卷积处理，从而获取高分辨率的序列图像，通过三维重建，实现高分辨率的细胞三维显示。在数字共焦显微技术中，为了获取精确的等间隔生物细胞序列切片图像，需通过驱动显微镜物镜与载物台之间数十纳米的相对步进微位移来进行采集。而采用压电陶瓷控制技术进行显微镜物镜驱动，可以高精度地实现显微镜物镜与载物台之间的相对步进微位移。为了发挥压电陶瓷物镜驱动器的高精度和高响应速度的特点，控制技术是控制系统的核心。

极大与极小，一直是科学研究中的两个研究方向，应用光学的最主要的两大应用一个是望远镜，另一个便是显微镜，便是对应着极大与极小。望远镜是对远处物体成像从而能被人眼或者其他成像仪器观测到的工具，最典型的比如用于观测太空的Hubble空间望远镜；而生物学中许多问题需要深入到微观层次进行研究，显微镜的发展则极大的推动了人类对生物学研究的进程。显微镜可以分为：光学显微镜和电子显微镜，二者又可以向下继续分类，本文主要介绍一下光学显微镜。

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图1：Hubble望远镜与显微镜结构图及其成像图片

显微镜的发展历程

一项技术的发展往往离不开材料、工艺等其他方面的的发展，显微镜也是如此，从发明之初到现代成为生物学研究必不可少的工具，其发展伴随着光学材料制造、加工研磨工艺的改进。现将其发展历程大致分为萌芽阶段、发展阶段、成熟阶段等时期。

图2：显微镜发展的3个阶段

萌芽阶段

早在2500年前，《墨经》中就记载了凹面镜以及凸面镜的成像，对凹面镜可以成放大像进行阐述[1]；而对于透镜的成像，人们普遍认为，透镜的起源可以上溯到 2000 年前古罗马哲学家塞内加 (Seneca)，他曾经叙述到“水晶球可以放大字”[2]

近代显微镜被认为由荷兰眼睛制造商Zacharias Janssen父子所制造，16世纪末，Janssen父子将一些透镜放在镜筒中，发现可以比单个透镜更好地放大微小物体，尽管没有一台Janssen显微镜流传于世，荷兰王室用3个套管制作了一台Janssen显微镜，这个显微镜可以实现3X-9X的放大倍率[3]。

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图3：Zacharias Janssen及其显微镜复刻品

此后，列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek，Netherlands，1632.10.24-1723.8.26)制造出放大倍数更高的显微镜，列文虎克是一个布匹商人，但却有着研磨镜头的爱好，列文虎克的显微镜只有一个镜片（更像是我们今天的放大镜），他将自己研磨的镜片连接到金属固定器上，尽管一个镜片增加了色差，但相比于Janssen组合式显微镜，却更实用，列文虎克将大部分收入投入到研磨镜头中，发现了细菌、酵母等，同时也对水中的一些原生小动物进行研究，发现了许多有趣的生命现象[4]。随后英国的显微镜之父罗伯特胡克(Robert Hooke, England, 1635.7.18-1703.3.3)仿制一台与列文虎克一样的显微镜，验证了细菌、酵母等的存在，并根据自己的设计对显微镜进行改进，制作复式显微镜，发表《显微镜》一书。用自己制造的显微镜观察植物组织，于1665年发现了植物细胞（实际上看到的是细胞壁），并命名为“cell”，至今仍被使用[6]。

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图4：Robert Hooke及其手稿

发展阶段

显微镜应用逐渐推广，但由于玻璃的质量和制作工艺水平还不是很高，使用显微镜观察到的物体形状歪曲，图像质量较差，人们逐渐发现并解决了一些限制成像的清晰程度的因素：比如色差和球差。

色差：光透过镜片，不同颜色的光会发生不规则的弯曲，就会导致色差，影响到成像质量。这个难题被18世纪30年代的Chester Moor Hall(1703.12.9-1771.3.17)解决了[6]。他发现，如果使用不同形状和不同光线弯曲特性的第二镜片他可以重新对齐颜色，无需牺牲第一镜片的放大倍率。

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图5：色差示意图

球差：一个完美的镜片可以聚集所有的入射光线于光轴的某一点。对于一个有球面像差的实体镜片，光线进入镜片的距离越远于光轴，那么镜片可以把光线弯曲的越严重，因此无法生成一个完美的焦点。1830年，利斯忒(Joseph Jackson Lister，England，1786.1.11-1869.10.24)用几个有特定间距的透镜组减小了球面像差，进一步改进了显微镜【7】。图片关键词

图6：Joseph Jackson Lister和球差示意图

1872，Abbe将显微成像的理论总结为阿贝正弦条件(Abbe Sine Condition): hNsinU = h'N'sinU'，这里h和h'是物体高度，U和U'是入射和出射的角度，N和N'是球形曲面像场介质的折射率，Abbe还总结出因衍射限制光学显微镜所能达到的极限分辨率，R=λ/(n﹒sin(α))，这里R是分辩率，α是孔径张角(angular aperture)，λ是波长，n﹒sin(α)是数值孔径, n代表折射率。有了这些理论基础，但最初没有质量均匀的符合质量要求的玻璃来验证。

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图7：Ernst Abbe和他的纪念碑上的分辨率极限理论

直到1881年，Abbe遇到同为耶拿大学的玻璃化学家Schott，由于对显微成像的共同兴趣，二人很快开始合作，研制新型玻璃，改进玻璃的制造工艺等，取得了很多重要研究成果。

伴随着阿贝(Ernst Abbe，German，1840.1.23-1905.1.14)等科学家从理论上研究光学显微成像，肖特(Otto Schott，German，1851-1935)等研究光学材料，以及Zeiss等先进光学设备制造商的成立，显微镜技术在基础理论和所用原料上取得本质上的提升，逐渐有了现代显微镜的特性。

成熟阶段

在这一阶段，显微镜有了其基本结构，但随着人们对成像要求的改变与成像质量的提高，以及光学成像理论的不断完善，产生许多新的成像方式以及我们至今常用的显微镜，为更好地认识常用的显微成像技术，这里按照每种技术的发展来叙述。

·荧光显微成像(Fluorescence microscopy)

19世纪由于显微镜的发明，促使了细胞学说的诞生，极大地推动了生物学的发展，细胞学说被恩格斯称为19世纪三大发明之一。在这一时期也发明了染料，用染料染色后对细胞进行观察，可以提高对比度，但染料染色存在一定局限，对活体标本存在毒性，很难实现特异性染色等，而且染料带来的对比度也逐渐不能满足人们的需求。1871年约翰﹒弗雷德里克﹒威廉﹒阿道夫﹒冯﹒拜尔（Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer）首先分析出吲哚结构并合成荧光素，也因此获1905年诺贝尔化学奖。而第一台荧光显微镜是由奥斯卡﹒黑姆斯泰特（Oskar Heimstadt）于1911年发明，在这之前，奥古斯特﹒科勒(August Köhler)根据Abbe的波长越短分辨率越高的理论，于1904年造出了第一个紫外显微镜，科勒发现如果用较短的紫外光激发某些物质会诱导长波长荧光的发射，奥斯卡﹒黑姆斯泰特根据科勒的描述发明了第一台荧光显微镜。之后1929年德国药物学家飞利浦﹒埃林杰(Philipp Ellinger)和解剖学家奥古斯特﹒赫特(August Hurt)发明了落射荧光显微镜(epi-fluorescence microscopy)，1961年阿尔伯特﹒库恩斯(Albert Coons)将荧光素耦联到抗体上，抗体只结合特异性的抗原分子，不仅提高了标记的特异性，又因为荧光染料的应用提高了对比度，开创了免疫荧光显微镜的新纪元，1967年荷兰人约翰﹒塞巴斯蒂安﹒富勒姆(Johan Sebastiaan Ploem)发明二色滤光片后，大大降低了背景噪声，落射荧光显微镜才真正得到普及应用。

荧光显微镜原理如图，二项色镜可以反射较小波长的光透射较长波长的光，光通过一个窄带滤波片通过二向色镜反射到样本表面，基于荧光原理，荧光样本会散射出波长较长的荧光，这些含有样本信息的荧光透过二向色镜，滤光片成像在CCD上。

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图9：荧光显微镜原理示意图

·暗场显微成像(Dark-field microscopy)

暗场显微镜的工作原理是通过使用中央遮光板或暗视野遮光器，使得中央光束被遮挡，从而在没有样本时并没有光投射到CCD上（图中外侧锥形光线），因此这时整个视场是黑暗的，当有样本时，样本散射的光会通过透镜进入CCD从而成像，这种成像方法样本与背景对比度较大，可以清楚的看到透明微小颗粒。暗场显微镜简单高效，适用于活体不能染色的生物样本，其局限性便是成像的光强较低，这也意味着样本需要足够强的照明，可能导致对样本的损伤[8]。

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图10：暗场显微成像原理示意图

·相衬显微成像(Phase-contrast microscopy)

1932年弗里茨﹒塞尔尼克(Frits Zernike)发明了相位差显微镜来研究无色和透明的生物样品，这样细胞不再需要染色，塞尔尼克因此获得了1953年诺贝尔物理学奖。相衬显微成像是把光通过透明样本所产生的相位变化，转换成成像光强的变化，简单来说，细胞各部分折射率和厚度的不同会导致透过它的光产生相位的变化，通过相位板，利用光的干涉原理，将感知不到的相位变化转换成可感知到的光强的变化，这样提高了成像的对比度。

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图11：Zernike和相衬显微镜原理示意图

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图12：明场成像和相衬成像下的细胞

·偏振显微成像(Polarizing microscopy)

偏振显微镜由德国物理学家马克﹒贝雷克(Mark Berek)在二次世界大战前发明，它是指利用偏振光成像的的统称。偏振显微成像原理如下，用一个偏振片产生线偏振光，在成像前加一片与偏振方向相垂直的偏振片，这样在没有样本时，并没有光进入CCD，当有样品存在时，由于样品的特性使得光的偏振特性发生改变，从而进入成像装置。W. J. Schmid在1937年观察到了纺锤体的纤维状结构，但图像有些模糊不清。1953年Shinya Inoué用自制的改进型偏振显微镜证实了纺锤体的发现，极大的推动了生物学的发展[9]。偏振显微成像常用于具有双折射现象的样本，由于双折射性质的物质利用偏振显微成像能形成更明显的对比度，常见于矿物研究中。

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图13：偏振显微成像原理示意图

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图14：Shinya Inoué的研究工作图

·微分干涉相衬显微成像(DIC: Differential interference contrast microscopy)

微分干涉相衬显微成像是由乔治﹒诺马尔斯基(Georges Nomarski)于1952年发明，因此也叫Nomarski interference contrast 或 Nomarski microscopy，可以用来研究非染色的活生物样品。其工作原理是人为的先将偏振光通过棱镜分成两束正交的偏振光，然后在观察前再通过棱镜将两束光合并形成干涉，DIC和相衬显微成像之间最明显的区别是：DIC形成伪三维阴影投影图像，相衬显微成像不会产生具有明显三维特征的图像。然而在DIC中，图像中明显的山丘和山谷绝不能被误认为标本中实际地形剖面的标志，因此应始终谨慎解读，此外对于DIC和相衬显微成像，并不能说二者谁更好，对于生物成像，它们是互补关系[10]。

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图15：DIC工作原理图

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图16：DIC(右)和相衬(左)的成像对比

后续

常见的光学显微镜还可根据照明形式分为透射式显微镜、反射式显微镜；按照物镜与样本的放置分为正置显微镜、倒置显微镜。基于对被观察物的不同性质，我们在选择显微镜的时候也是有很大区别，不是一成不变的。对于生物的研究，我们用得多的就是普通的正置生物显微镜和倒置生物显微镜。

正置生物显微镜是我们在实验室和教室中常见的生物显微镜，它的物镜转换盘朝向是向下的，载物台在物镜下方。当观察物体时，把被观察物放于载物台，物镜从上方靠近载玻片进行观察，工作距离比较短，观察切片等适合用正置生物显微镜。

倒置显微镜的物镜是向上的，载物台在物镜上方。当观察活体细胞时适合用这种显微镜，因为正置生物显微镜的工作距离很短，观察培养皿里面的活体细胞根本没办法观察。用倒置显微镜就不一样了，我们只需把培养皿放于载物台上就能进行观察即可。

上文按照工作原理介绍了相对传统的一些光学显微镜，随着激光光源的发展，又涌现出其他的一些光学显微成像手段，比如共聚焦成像，双光子成像，超分辨成像，结构照明显微成像，4Pi成像，光活化显微成像等技术逐渐发展，鉴于篇幅原因，后续补充。

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